Análise invasiva e não invasiva do fuso meiótico de oócitos humanos obtidos de ciclos estimulados: dados preliminares / Invasive and noninvasive analysis of the meiotic spindle of human oocytes obtained from stimulate cycles: preliminary results

OBJETIVOS: Avaliar a concordância entre as técnicas de microscopia de polarização e microscopia confocal na avaliação do fuso meiótico de oócitos humanos maturados in vivo. MÉTODOS: Estudo prospectivo que avaliou oócitos com o primeiro corpúsculo polar extruído obtidos de mulheres inférteis submetidas à estimulação ovariana para realização de injeção intracitoplasmática de espermatozoide. Os oócitos com o primeiro corpúsculo polar extruído foram avaliados por meio da microscopia de polarização e, imediatamente após, foram fixados e corados para avaliação dos microtúbulos e cromatina pela microscopia confocal de alto desempenho. Foram comparadas as técnicas de microscopia de polarização e confocal, de acordo com a visualização ou não do fuso meiótico pela microscopia de polarização e a presença ou não de anomalias meióticas à análise pela microscopia confocal. Foram calculados os intervalos de confiança, o índice de Kappa e a concordância entre as metodologias, considerando a análise da microscopia de imunofluorescência como padrão-ouro para avaliação de normalidade do fuso e distribuição cromossômica oocitária. RESULTADOS: Observou-se que 72,7% dos oócitos em metáfase II com fuso celular não visível à polarização apresentaram anormalidades meióticas à análise confocal e que 55,6% dos oócitos em metáfase II com fuso celular visível à polarização apresentaram-se como oócitos anormais à análise confocal. Somente 44,4% dos oócitos com fuso celular visível à polarização apresentaram-se como normais à análise confocal. A concordância entre os métodos foi de 51,1% (Kappa: 0,11; IC95% -0,0958 - 0,319). CONCLUSÕES: A baixa concordância entre a microscopia de polarização e a confocal na avaliação do fuso meiótico oocitário sugere que a visualização do fuso meiótico de oócitos humanos em metáfase II pela microscopia de polarização tem limitado o valor preditivo de normalidade meiótica oocitária.

PURPOSE: To evaluate the concordance between polarization microscopy and confocal microscopy techniques in the evaluation of the meiotic spindle of human oocytes matured in vivo. METHODS: Prospective study that evaluated oocytes with the first polar extruded body obtained from infertile women who had undergone ovarian stimulation for intracytoplasmic sperm injection. The oocytes with the first polar extruded body were evaluated by polarization microscopy and were then immediately fixed and stained for microtubule and chromatin evaluation by high-performance confocal microscopy. We determined the correlation of polarization microscopy with confocal microscopy in the detection of meiotic oocyte anomalies, and we also evaluated the percentage of oocytes with a visible and non-visible cell spindle by polarization microscopy and with meiotic normality and abnormalities by confocal microscopy. Confidence intervals, Kappa's index and concordance between the methodologies were calculated, considering immunofluorescence microscopy analysis as the golden-standard for evaluating normal spindle and oocyte chromosome distribution. RESULTS: We observed that 72.7% of metaphase II oocytes with a nonvisible meiotic spindle by polarization microscopy showed no meiotic abnormalities by confocal analysis and 55.6% of metaphase II oocytes with a visible meiotic spindle by polarization microscopy were found to be abnormal oocytes by the confocal analysis. Only 44.4% of oocytes with a visible meiotic spindle by polarization microscopy were found to be normal by confocal analysis. Concordance between the methods was 51.1% (Kappa: 0.11; 95%CI -0.0958 - 0.319). CONCLUSIONS: The low correlation between polarization microscopy and confocal microscopy in the assessment of oocyte meiotic spindle suggests that visualization of the meiotic spindle of human oocytes at metaphase II by polarization microscopy is not a good indicator of oocyte meiotic normality.

Oócitos aparentemente maduros injetados em telófase I apresentam piores resultados de reprodução assistida / Apparently matured oocytes injected in telophase I have worse outcomes from assisted reproduction

OBJETIVO: Avaliar o estágio de maturação nuclear de oócitos com o primeiro corpúsculo polar (CP) visível de pacientes inférteis submetidas à estimulação ovariana para injeção intracitoplasmática de espermatozoide (ICSI) e comparar os resultados da injeção intracitoplasmática de espermatozoide entre os oócitos em telófase I (TI) e metáfase II (MII), e entre aqueles em metáfase II com e sem fuso celular visível. MÉTODOS: Estudo prospectivo que incluiu 106 pacientes inférteis submetidas à injeção intracitoplasmática de espermatozoide. Foram incluídas pacientes com idade menor ou igual a 38 anos, hormônio folículo estimulante (FSH) basal menor que 10 mIU/mL e índice de massa corpórea (IMC) menor que 30 kg/m². Foram excluídas pacientes com doenças sistêmicas, com qualquer infecção ativa, tabagistas ou que fizeram uso de medicações hormonais e anti-inflamatórias hormonais e não hormonais nos últimos dois meses, previamente à programação para o procedimento de reprodução assistida. Os oócitos com extrusão do primeiro corpúsculo polar foram avaliados pela microscopia de polarização, imediatamente antes da realização da injeção intracitoplasmática de espermatozoide, e caracterizados quanto ao estágio de maturação nuclear (telófase I ou metáfase II). Os oócitos em metáfase II foram avaliados de acordo com a presença ou não do fuso meiótico. Foram analisadas as taxas de fertilização, clivagem e o número de embriões de boa qualidade no segundo dia (D2) de desenvolvimento. Os dados foram analisados comparativamente através do teste exato de Fisher. Em todas as análises foi considerado o nível de significância de 5% (p<0,05). RESULTADOS: O fuso meiótico de 516 oócitos foi visualizado através da microscopia de polarização. Dezessete dos 516 oócitos avaliados estavam em telófase I (3,3%) e 499 (96,7%) em metáfase II. Os oócitos injetados em telófase I apresentaram taxas de fertilização significativamente menores do que os injetados em metáfase II (53 e 78%, respectivamente) e não produziram nenhum embrião de boa qualidade no segundo dia. Comparando-se os oócitos com e sem fuso celular visível, não foi observada diferença significativa nos resultados de injeção intracitoplasmática de espermatozoide. CONCLUSÕES: Oócitos injetados em telófase I apresentaram menores taxas de fertilização quando comparados aos em metáfase II. É possível que a análise do estágio de maturação nuclear oocitária, por meio da microscopia de polarização, possa ser utilizada como fator de predição das taxas de fertilização pós-injeção intracitoplasmática de espermatozoide.

PURPOSE: To evaluate the nuclear maturation stage and the presence of meiotic spindles of in vivo matured oocytes from infertile women undergoing stimulated cycles for intracytoplasmic sperm injection (ICSI) and compare intracytoplasmic sperm injection outcomes between oocytes in telophase I (TI) and metaphase II (MII), and the ones with and without visible meiotic spindle. METHODS: A prospective and controlled study with 106 infertile patients who underwent ovarian stimulation for intracytoplasmic sperm injection purposes. Patients aged 38 years or less, with basal follicle stimulating hormone (FSH) less than 10 mIU/mL and body mass index (BMI) less than 30 kg/m². Were included patients presenting any systemic diseases, any active infection, smokers or patients who had been using hormonal medications and hormonal and nonhormonal anti-inflammatory drugs for the past two months prior to the assisted reproduction procedure were excluded. The oocytes with the first polar body extruded (in vivo matured oocytes) were imaged by polarization microscopy immediately before intracytoplasmic sperm injection and characterized according to nuclear maturation stage (telophase I and metaphase II) and to the presence of a meiotic spindle. We analyzed the fertilization rates, cleavage, number of good quality embryos on the second day (D2) from oocytes on telophase I versus those in metaphase II, and metaphase II visible spindle versus non-visible ones. Data were analyzed comparatively by Fisher's exact test. The level of significance was set at 5% in all analyses (p<0.05). RESULTS: The meiotic spindles of 516 oocytes were imaged using polarization microscopy. From the 516 oocytes analyzed, seventeen were in telophase I (3.3%) and 499 (96.7%) in metaphase II. The oocytes injected in telophase I had significantly lower fertilization rates than those injected in metaphase II (53 and 78%, respectively) and produced no good quality embryos on day 2. When the oocytes with and without a visible meiotic spindle were compared, there was no significant difference in the intracytoplasmic sperm injection results. CONCLUSIONS: Oocytes injected in telophase I showed lower fertilization rates when compared to those in metaphase II. It is possible that the analysis of oocyte nuclear maturation by polarization microscopy can be used as a predictor of fertilization after intracytoplasmic sperm injection.

Anomalias meióticas de oócitos de pacientes com endometriose submetidas à estimulação ovariana / Meiotic abnormalities of oocytes from patients with endometriosis submitted to ovarian stimulation

OBJETIVO: avaliar o fuso meiótico e a distribuição cromossômica de oócitos maturados in vitro, obtidos de ciclos estimulados de mulheres inférteis com endometriose e fatores masculino e/ou tubário de infertilidade (Grupo Controle), comparando as taxas de maturação in vitro (MIV) entre os dois grupos avaliados. MÉTODOS: quatorze pacientes com endometriose e oito com fator tubário ou masculino, submetidas à estimulação ovariana para injeção intracitoplasmática de espermatozóide, foram selecionadas, prospectiva e consecutivamente, e constituíram os Grupos de Estudo e Controle, respectivamente. Oócitos imaturos (46 e 22, respectivamente, dos Grupos Endometriose e Controle) foram submetidos à MIV. Oócitos que apresentaram a extrusão do primeiro corpúsculo polar foram fixados e corados para avaliação dos microtúbulos e cromatina por técnica de imunofluorescência. A análise estatística foi realizada utilizando o teste exato de Fisher, com significância estatística quando p<0,05. RESULTADOS: não se observou diferença significativa nas taxas de MIV entre os dois grupos avaliados (45,6 e 54,5 por cento, respectivamente, nos Grupos Endometriose e Controle). A organização cromossômica e do fuso meiótico foi observada em 18 e 11 oócitos dos Grupos Endometriose e Controle, respectivamente. No Grupo Endometriose, oito oócitos (44,4 por cento) se apresentavam como metáfase II (MII) normais, três (16,7 por cento) MII anormais, cinco (27,8 por cento) estavam em estágio de telófase I e dois (11,1 por cento) sofreram ativação partenogenética. No Grupo Controle, cinco oócitos (45,4 por cento) se apresentavam como MII normais, três (27,3 por cento) MII anormais, um (9,1 por cento) estava em estágio de telófase I e dois (18,2 por cento) sofreram ativação partenogenética. Não se observou diferença significativa na porcentagem de anomalias meióticas entre os oócitos em MII dos dois grupos avaliados. CONCLUSÕES: os dados do presente estudo não demonstraram diferença...

PURPOSE: to evaluate the meiotic spindle and the chromosome distribution of in vitro mature oocytes from stimulated cycles of infertile women with endometriosis, and with male and/or tubal infertility factors (Control Group), comparing the rates of in vitro maturation (IVM) between the two groups evaluated. METHODS: fourteen patients with endometriosis and eight with male and/or tubal infertility factors, submitted to ovarian stimulation for intracytoplasmatic sperm injection have been prospectively and consecutively selected, and formed a Study and Control Group, respectively. Immature oocytes (46 and 22, respectively, from the Endometriosis and Control Groups) were submitted to IVM. Oocytes presenting extrusion of the first polar corpuscle were fixed and stained for microtubules and chromatin evaluation through immunofluorescence technique. Statistical analysis has been done by the Fisher's exact test, with statistical significance at p<0.05. RESULTS: there was no significant difference in the IVM rates between the two groups evaluated (45.6 and 54.5 percent for the Endometriosis and Control Groups, respectively). The chromosome and meiotic spindle organization was observed in 18 and 11 oocytes from the Endometriosis and Control Groups, respectively. In the Endometriosis Group, eight oocytes (44.4 percent) presented themselves as normal metaphase II (MII), three (16.7 percent) as abnormal MII, five (27.8 percent) were in telophase stage I and two (11.1 percent) underwent parthenogenetic activation. In the Control Group, five oocytes (45.4 percent) presented themselves as normal MII, three (27.3 percent) as abnormal MII, one (9.1 percent) was in telophase stage I and two (18.2 percent) underwent parthenogenetic activation. There was no significant difference in meiotic anomaly rate between the oocytes in MII from both groups. CONCLUSIONS: the present study data did not show significant differences in the IVM or in the meiotic anomalies...

Avaliação de anomalias meióticas de oócitos em pacientes com síndrome dos ovários policísticos submetidas à estimulação ovariana / Evaluation of meiotic abnormalities of oocytes from polycystic ovary syndrome patients submitted to ovarian stimulation

OBJETIVO: avaliar o fuso meiótico e a distribuição cromossômica de oócitos maturados in vitro, obtidos de ciclos estimulados de mulheres inférteis com síndrome dos ovários policísticos (SOP) e fatores masculino e/ou tubário de infertilidade (Grupo Controle) e comparar as taxas de maturação in vitro (MIV) entre os dois grupos avaliados. MÉTODOS: cinco pacientes inférteis com SOP e oito pacientes controles, submetidas à estimulação ovariana para injeção intracitoplasmática de espermatozóide, foram selecionadas prospectiva e consecutivamente, e constituíram os grupos de estudo e Controle, respectivamente. Oócitos imaturos captados após estimulação ovariana para a realização de injeção intracitoplasmática de espermatozóide (21 e 29, respectivamente, nos Grupos SOP e Controle) foram submetidos à MIV. Apenas os oócitos que apresentaram a extrusão do primeiro corpúsculo polar após a MIV foram fixados e submetidos à imunocoloração e análise por microscopia de fluorescência para avaliação morfológica do fuso e da distribuição cromossômica. A análise estatística foi realizada utilizando o teste exato de Fisher, com significância estatística quando p<0,05. RESULTADOS: as taxas de MIV foram similares entre os dois grupos (47,6 e 44,8 por cento, respectivamente, nos Grupos SOP e Controle). Seis dos dez oócitos (60 por cento) analisados do grupo de estudo e quatro dos 12 oócitos (33,3 por cento) analisados do Grupo Controle apresentaram anomalias meióticas, caracterizadas por anomalias do fuso e/ou distribuição cromossômica oocitária, sem diferença significativa entre os grupos. CONCLUSÕES: os dados do presente estudo não demonstraram diferença significativa nas taxas de MIV e nas proporções de anomalias meióticas entre os oócitos maturados in vitro, provenientes de ciclos estimulados de pacientes com SOP, quando comparados aos controles.

PURPOSE: to evaluate the meiotic spindle and the chromosome distribution of in vitro matured oocytes obtained from stimulated cycles of infertile women with polycystic ovary syndrome (PCOS) and with male factor and/or tubal infertility (Control Group) and compare in vitro maturation (IVM) rates between the groups analyzed. METHODS: five infertile patients with PCOS and eight controls, submitted to stimulated cycles for intracytoplasmic sperm injection, were selected prospectively and consecutively, and respectively assigned to the study group and the Control Group. Immature oocytes (21 and 29, respectively, from PCOS and Control Group) were submitted to IVM. After IVM, oocytes with first polar body extruded were fixed and submitted to immunostaining and fluorescence microscopy for morphological evaluation of the spindle and of chromosome distribution. Statistical analysis was performed by the Fisher test with significance, when p<0.05. RESULTS: IVM rates were similar between groups (47.6 e 44.8 percent, respectively, for PCOS and Control Group). Six of the ten oocytes (60 percent) from the study group and four of the 12 oocytes (33.3 percent) from the Control Group presented meiotic anomalies of the spindle and/or anomalous chromosome distribution, without statistical difference between groups. CONCLUSIONS: data from the present study did not demonstrate significant difference neither in IVM rates nor in the proportions of meiotic anomalies between in vitro matured oocytes obtained from stimulated cycles from PCOS patients and control ones.

Gametogênese: estágio fundamental do desenvolvimento para reprodução humana / Gametogenesis: fundamental stage the development for human reproduction

A reprodução é o mecanismo essencial para perpetuação e diversidade das espécies, assim como para a continuidade da vida. Os gametas são os veículos de transferência dos genes para as próximas gerações. A gametogênese pode ser caracterizada por três etapas distintas denominadas multiplicação (mitose), crescimento e maturação (meiose), que se diferenciam em vários aspectos na espermatogênese e na oogênese. A oogênese diferencia-se da espermatogênese na ocorrência do processo ao longo da vida do indivíduo, no número de gametas formados, nas etapas de multiplicação, crescimento e maturação, assim como nas diferenciações e maturações citoplasmáticas e nucleares dos gametas masculinos e femininos. O processo da oogênese em relação à maturação oocitária ainda merece mais estudos, pois os aspectos bioquímicos e genéticos deste processo precisam ser mais bem esclarecidos. Por meio da gametogênese masculina e feminina a natureza proporcionou a fertilidade e a capacidade de gerar filhos a casais de diferentes espécies que se reproduzem sexuadamente incluindo a espécie humana. Quando existem falhas neste mecanismo por diferentes motivos como oligospermia, teratozoospermia, astenoospermia, azoospermia, ou distúrbios da ovulação, endometriose, fatores tubários, esterilidade sem causa aparente, casais podem recorrer àstecnologias de Reprodução Assistida como inseminação intra-uterina, fertilização in vitro, injeção intra-citoplasmática de espermatozóides, e de maturação oocitária in vitro para chegarem à plenitude da reprodução.

The reproduction is the essential mechanism for perpetuation and diversity of the species, as well as for the continuity of the life. The gametes are the vehicles of transfer of the genes for the next generations. The gametogenesis can be characterized by three stages denominated different multiplication (mitosis), growth and maturation (meiosis), which differ inseveral aspects in the spermatogenesis and in the oogenesis. The oogenesis differs of the spermatogenesis in several aspects as in the occurrence of the process along the individual’s lifesuch as in the number of formed gametes, in the multiplication stages, growth and maturation, aswell as in the differentiations and cytoplasmtic and nuclear maturations of the masculine and feminine gametes. The process of the oogenesis in relation to the oocyte maturation still deserve many studies, because the biochemical and genetic aspects of this process need to be better explained. Through the masculine and feminine gametogenesis the nature provided the fertility and the capacity of generating children to you marry of different species that sexually reproduce including the human species. When flaws exist in this mechanism for different reasons as oligospermy, teratozoospermy, astenoospermy, azoospermy or ovulation disturbs, endometriosis, tubal factors, or unexplained infertility couples can fall back upon the technologies of Assisted Reproduction as in vitro fertilization, intracytoplasmic sperm injections, artificial insemination, invitro maturation of oocytes to reach the fullness of the reproduction.

Utilizaçäo da técnica injeçäo intracitoplasmática de espermatozóide (ICSI) no tratamento da infertilidade conjugal em um serviço público universitário. Nossa realidade em três anos / Use of the intracytoplasmic sperm injection (ICSI) technique for the treatment of infertile couples at an Academic Public Service. Our reality over a three year period

Avaliar os resultados da ICSI em um serviço público universitário no tratamento da infertilidade conjugal. Estudo retrospectivo de 238 ciclos de ICSI de 214 pacientes, realizados de julho de 1998 a julho de 2001. Foram obtidos 1.925 oócitos, destes 1.410 (73,25 por cento) encontrava-se em MII. As perdas oocitárias na ICSI, que no primeiro ano foram de 9,84 por cento (37 oócitos) reduziram-se a 2,05 por cento (18 oócitos) no terceiro ano. As taxas de fertilizaçäo aumentaram significativamente de 20,94 por cento no primeiro ano para 57,49 por cento no terceiro ano (p<0,001). Näo ocorreram mudanças com relaçäo às taxas de implantaçäo, com valores próximos a 13,5 por cento. A porcentagem de ciclos em que näo houve transferência embrionária diminui de 27,08 por cento (13 ciclos) para 8,47 por cento (10 ciclos) no terceiro ano. Dos embriöes que resultaram em gravidez 80 por cento embriöes de boa qualidade. As taxas de gravidez por transferência foram respectivamente de 20 por cento e 24,07 por cento, no primeiro ano e terceiro ano da ICSI. As gestaçöes múltiplas aumentaram de 20 por cento para 46,2 por cento no último ano analisado. A implantaçäo de um programa de ICSI tem dificuldades em seu início, especialmente em um Serviço Público. Entretanto, o aprendizado propiciou um aumento das taxas de fertilizaçäo e as melhorias técnicas da ICSI.